Laporan Praktikum Biokimia Ternak Acara Mikrobia Dalam Rumen

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA TERNAK

ACARA II

MIKROBIA DALAM RUMEN

Disusun oleh :

Kelompok XXVIII

Maya Kurnia Kusuma                                                PT/06438

Amelia Rahmawati Santoso                         PT/06483

Nurus Sobah                                                   PT/06587

Nino Sugiyanto                                               PT/06602

Santa Astria Simbolon                                   PT/06613

Asisten : Qorina

LABORATORIUM BIOKIMIA NUTRISI

BAGIAN NUTRISI DAN MAKANAN TERNAK

FAKULTAS PETERNAKAN

 UNIVERSITAS GADJAH MADA

YOGYAKARTA

2014

 

ACARA II

MIKROBIA DALAM RUMEN

 

Tujuan Praktikum

Praktikum mikrobia dalam rumen bertujuan untuk mengetahui kadar protein mikrobia rumen, aktivitas enzim CMC-ase, dan kadar amonia cairan rumen.

 

Tinjauan Pustaka

Ciri khas dari ternak ruminansia yaitu lambung jamak atau poligastrik yang memiliki empat segmen yaitu rumen,retikulum, omasum,abomasum. Keempat segmen ini memiliki aktivitas yang berbeda-beda. Ruminansia secara spesifik mampu menyintesis asam-asam amino dari unsur-unsur yang dihasilkan oleh berbagai aktivitas dirumen, karenanya ruminansiamampu mengonsumsi urea ( non-protein nitrogen) dalam jumlah terbatas,yang di dalam rumen terurai menjadi amonia (NH₃) dan merupakan bahan- bahan utama pembentuk asam-asam amino. Selain dari bahan pakan yang dikonsumsinya, kebutuhan protein ternak ruminansia dapat juga dipenuhi dari mikrobia rumen (Sodiq,2008).

Kecernaan merupakan hasil proses degradasi molekul makro yang terdapat di dalam bahan pakan menjadi senyawa yang sederhana yang dapat diserap dari organ cerna. Pencernaan pada ruminansia ditandai oleh adanya proses fermentasi yang ekstensif dalam organ retikulo-rumen. Pencernaan fermentatif ini terjadi melalui aktivitas mikrobia pada kondisi lingkungan anaerobik, temperatur yang konstan yaitu 39⁰C dalam rentang pH antara 5,5 sampai 7,0 (sedikit asam sampai netral)    (Ginting et.al, 2012). Menurut Abidin (2008) bahwa komposisi zat-zat makanan (dalam presentase bahan kering) yang dibutuhkan oleh sapi dan harus tersedia di dalam pakan ternak ruminansi,seperti karbohidrat sebanyak 60-75%, dengan adanya rumen karbohidrat yang dibutuhkan oleh ruminansia berasal dari sumber yang lebih bervariasi yaitu selulosa, hemiselulosa, pektin, dan sedikit pati. Selulosa merupakan bahan organik yang terdapat pada tanaman dalamjumlah besar, seluruh karbohidrat ini akan dirubah menjadi VFA (volatil fatty acid). Keberadaan Mikrobia dalam rumen yang mampu mendegradasi protein menjadi ikatan-ikatan peptida dan gas metan (NH₃) serta menyusunnya menjadi asam-asam amino,baik esensial maupun non esensial. Keberadaan mikrobia rumen inilah yang menyebabkan ruminansia yang mampu mengonsumsi non-protein nitrogen seperti urea.

Menurut Lamid et.al (2011) bahwa di dalam rumen ternak ruminansia mengandung bakteri dan fungi yang mampu mencegah lignoselulosa dan lignohemiselulosa. Salah satu genus bakteri yang hidup di rumen diantaranya adalah bakteri selulolitik yang memiliki kemampuan mendegredasikan selulosa pada tanaman dengan menghasilkan enzim selulase. Degradasi selulosa dilakukan dengan bantuan enzim selulase menjadi hasil akhir glukosa.

 

 

Materi dan Metode

 

Materi

Alat. Alat yang digunakan dalam praktikum mikrobia dalam rumen antara lain: tabung reaksi, safelock tube, spektrofotometer, pipet ukur, rak tabung reaksi, vortex, waterbath, pipet mikro, sentrifuge, gelas beker.

Bahan. Bahan yang digunakan dalam praktikum mikrobia dalam rumen adalah cairan rumen, NaOH 1 N, aquades, larutan Lowry A, enzim, sianida karbonat, sodium karbonat, potassium ferrisianida, larutan Lowry B, sodium tungstate, H₂SO₄ 1 N, campuran phenol, hipoklorid, enzim, buffer, CMC.

Metode

Preparasi sampel. Cairan rumen disentrifuge pada 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang dihasilkan disentrifugasi kembali pada 10.000 rpm selama 15 menit sehingga mendapatkan endapan mikrobia. Supernatan (enzim) yang dihasilkan digunakan untuk penentuan CMC-ase. Presipitat yang dihasilkan digunakan untuk penentuan protein mikrobia.

Penentuan kadar protein mikrobia. Sebanyak 0,5 mL NaOH ditambahkan pada presipitat hasil dari preparasi sampel lalu dididihkan pada suhu 90°C selama 10 menit selanjutnya dihasilkan sampel untuk penentuan mikrobia dan diencerkan dengan aquades sebanyak 6 kali. Dua tabung reaksi disiapkan untuk 0,5 mL sampel dan 0,5 mL aquades sebagai blanko. Masing-masing tabung ditambakan 2,5 mL larutan Lowry B lalu dihomogenkan dan dibiarkan selama 10 menit. Tahap selanjutnya, masing-masing ditambahkan 0,25 mL larutan Lowry A lalu dihomogenkan dan dibiarkan 30 menit. Absorbansi dibaca dengan spektrofotmeter λ750 nm dan dihitung kadar protein dengan persamaan Y = 0,0025X + 0,0146.

Penentuan aktivitas enzim CMC-ase.  Enzim yang digunakan adalah supernatan yang dihasilkan dari preparasi sampel. Empat tabung reaksi disiapkan, tabung ES diisi dengan 0,1 mL enzim, 0,4 buffer pH 5,5, CMC 1%, aquades 0,3 mL; tabung E diisi dengan 0,1 mL enzim, 0,4 buffer pH 5,5, aquades 1,3 mL; tabung S diisi dengan 0,4 buffer pH 5,5, CMC 1%,dan aquades 0,4 mL; tabung BL diisi dengan 0,4 buffer pH 5,5 dan aquades 1,4 mL. Tahap selanjutnya, semua tabung yang telah terisi diinkubasi pada suhu 38⁰C selama 45 menit, enzim dimasukkan setelah tabung diinkubasi selama 1 menit. Aktivitas enzim dihentikan dengan menambahkan campuran 1 mL larutan sianida karbonat, 0,2 mL sodium karbonat, dan 2 mL larutan 0,05% potassium ferrisianida (pH 10,6) pada semua tabung setelah diinkubasi. Isi tabung kemudian dihomogenkan dengan vortex, lalu dipanaskan pada air mendidih selama 30 menit. Tabung didinginkan dan warna yang terjadi dibaca pada λ420 nm. Perhitungan absorbansi produk = Abs (BL-ES) – (BL-E) – (BL-S). Hasil perhitungan absorbansi produk digunakan untuk menghitung aktivitas CMC-ase berdasar persamaan regresi berikut :      Y= 0,002034X + 0,01858

Penentuan NH₃ cairan rumen. Larutan A (sodium tungstate) sebanyak 0,1 mL ditambah dengan 0,2 mL cairan rumen dicampurkan dengan 0,1 mL larutan B (H₂SO₄) dingin dan divortex lalu disentrifuge 15000 rpm selama 10 menit. Sebanyak 20 µL supernatan ditambah 2,5 ml larutan C (campuran phenol), lalu ditambahkan 2,5 ml larutan D (hipoklorid) dan dicampur. Larutan diinkubasi pada suhu 40°C selama 30 menit lalu didinginkan pada suhu kamar. Hasil pendinginan dibaca pada spektrofotometer pada λ630 nm lalu diabsorbansi dalam persamaan Y = 0,0068X + 0,0279.

 

 

Hasil dan Pembahasan

 

 

Preparasi sampel. Sentrifugasi cairan rumen pada 3000 rpm selama 15 menit pada saat preparasi sampel bertujuan untuk mengendapkan partikel pakan, lalu disentrifugasi kembali pada 10.000 rpm selama 15 menit untuk mendapatkan endapan mikrobia rumen. Menurut Yuwono (2010) bahwa ada dua macam prinsip sentrifugasi yang umum digunakan untuk pemisahan partikel didasarkan atas massa, ukuran, atau panjang partikel, dan densitas partikel.

Penentuan kadar protein mikroba. Penambahan NaOH pada presipitat uji protein mikrobia menyebabkan lisisnya membran sel, lalu dididihkan hingga 90°C untuk memecah sel mikrobia juga untuk membantu agar cepat lisis sehingga protein yang ada dalam mikrobia dapat keluar. Larutan Lowry B terdiri dari CuSO₄, Na₂CO₃, dan Na-kartartat, CuSO₄ memiliki fungsi untuk membentuk ikatan CuN sedangkan Na₂CO₃ dan Na-kartartat untuk melepaskan N. Pemberian larutan Lowry B pada sampel awalnya berwarna bening lama-kelamaan menjadi warna ungu karena terbentuknya ikatan CuN. Larutan Lowry A terdiri dari aquades dan folin, folin akan bereaksi dengan CuN membentuk folin-clocalteau yang memberi warna kompleks. Presipitat hasil preparasi sampel digunakan untuk kadar protein mikrobia karena hasil dari sentrifuge kedua adalah bahan yang akan diuji yaitu protein mikrobia. Prepitat diencerkan dengan NaOH maka  membran selmikrobia akan lisis sehingga protein di dalamnya akan keluar dengan dilakukannya pemanasan juga. Sampel selanjutnya ditambah dengan Lowry B yang mengandung CuSO₄, CuSO₄ akan bereaksi dengan N yang telah dilepaskan lalu membentuk ikatan CuN dengan penambahan Lowry A yang mengandung folin, folin akan mengikat CuN sehingga menjadi folin clocalteau yang berwarna biru.

Menurut Sari et.al. (2014) bahwa Lowry A berisi folin-clocateau dan diencerkan dengan aquades sedangkan larutan Lowry B berisi CuSO₄, Na₂CO₃, dan Na-kartartat. Bahan-bahan dalam pereaksi Lowry B ini memiliki fungsi yang berbeda-beda, CuSO₄ memiliki fungsi mereduksi fosfotungstat-fosfomolibdat, Na-kartartat berfungsi mencegah terjadinya pengendapan kupro oksida dalam reagen Lowry B sedangkan Na₂CO₃ digunakan sebagai garam yang mengkoordinasikan reaksi dalam suasana basa bersama dengan NaOH. Kadar protein mikrobia tercatat sebesar 72,8 mg/100mL dengan absorbansi produk sebesar 0,383, sedangkan menurut Nurhaita dkk (2008) kadar berkisar antara 10 sampai 23 mg/100 mL. Kadar protein mikrobia yang diperoleh melebihi  dari kadar seharusnya karena sintesis protein mikroba tergantung pada N yang cocok dan sumber karbohidrat.

Penentuan aktivitas CMC-ase. Aktivitas enzim ditentukan dengan menghitung gula mereduksi yang dibebaskan dari reaksi hidrolisis substrat CMC oleh enzim CMC-ase. Penentuan jumlah gula mereduksi yang dihasilkan menggunakan reaksi ferrisianida. Supernatan hasil dari preparasi sampel digunakan sebagai sumber enzim lalu diisi dengan  berbagai larutan berbeda lalu diinkubasi pada suhu 38⁰C untuk menyesuaikan dengan kondisi di dalam tubuh yang umumnya sebagai suhu optimal enzim. Larutan yang sudah diinkubasi 38⁰C selama 45 menit akan ditambahkan campuran larutan sianida karbonat, larutan 0,05% potassium ferrisianida, fungsi penambahan untuk menaikkan pH selanjutnya  tabung akan dihomogenkan lalu dipanaskan. Hasil praktikum penentuan aktivitas CMC-ase menunjukkan absorbansi produk sebesar 0,213. Kadar gula mereduksi yaitu sebesar 95,585 µmol/mL atau 18,93 x 10⁶ mg/L, sedangkan menurut Sutarno (2005), CMC-ase secara acak menghidrolisis bagian dalam 1,4-D-glikosidik dari glukosa, hasilnya memendeknya polimer glukosa secara cepat yang diikuti dengan meningkatnya gula reduksi secara perlahan-lahan. Besar kecilnya nilai aktivitas enzim mempengaruhi kadar gula reduksi yang dihasilkan selama aktivitas enzim berlangsung, saat pH 7 didapatkan konsentrasi gula reduksi sebesar 124,565 mg/L, sementara itu pada pH 4, 5, 6, 8, dan 9 secara berturut-turut didapatkan konsentrasi gula reduksi sebesar 112,826 mg/L; 82,391 mg/L; 78,043 mg/L; 68,913 mg/L dan 72,826 mg/L, sehingga dengan demikian dapat dikatakan bahwa semakin tinggi aktivitas enzim, maka semakin tinggi pula gula reduksi yang dihasilkan.

Mikrobia selulolitik pada umumnya akanmensekresikan tiga jenis enzim, yaitu: endoglukanase atau carboxymethylcellulase (CMC-ase), eksoglukanase, dan β-glukosidase. secara sinergis ketiga jenis enzim ini mendegradasi selulosa menjadi glukosa. Enzim CMC-ase memecah ikatan hidrogen yang ada di dalam struktur kristalin selulosa sehingga terbentuk rantai-rantai individu selulosa (Cai et al. (1999) dan Beauchemin et al.(2003) cit Prabowo dkk (2007)). Perbandingan kadar gula mereduksi dari hasil praktikum dengan literatur menunjukkan adanya perbedaan kadar gula mereduksi, kadar gula mereduksi saat praktikum lebih tinggi yaitu18,93 x 10⁶ mg/L sedangkan lietarur 78,043 mg/L. Menurut Sutarno (2001), faktor yang mempengaruhi kadar gula mereduksi adalah aktivitas enzim yang dapat menurunkan pH karena umumnya semua aktivitas enzim khususnya endoglukanase dipengaruhi oleh pH.

Penentuan NH₃ cairan rumen. Metode penentuan ammonia didasarkan pada reaksi indophenol yang menghasilkan senyawa biru stabil. Reaksi indophenol adalah reaksi antara ammonia dengan sodium phenat. Larutan A adalah larutan tungstate, reaksi A yaitu reaksi indophenol yang dikatalis menjadi warna biru yang stabil. Reaksi indophenol adalah reaksi antara reaksi amoniak dengan sodium penat. Larutan dingin yaitu larutan H₂SO₄, larutan C yang terdiri dari phenol, Na Nitroprusside, phenol kristal. Larutan D terdiri dari Hypocloride, NaOH pekat, Na₂HPO₄, Sodium Hypocloride. Semua reaksi akan menangkap ammonia. Larutan berwarna biru stabil setelah inkubasi pada 40°C. Tujuan inkubasi tidak lain adalah untuk menyesuaikan dengan suhu dalam rumen yaitu sekitar 38 sampai 42°C. Absorbansi produk yang didapatkan pada panjang gelombang 630 nm adalah sebesar 0,236. Kadar ammonia yaitu sebesar 0,307 mg/100mL. Hasil ini sudah sesuai dengan kadar amonia dalam rumen. Menurut Satter dan Styler (1974) dalam Nurhaita (2008) bahwa konsentrasi NH₃ cairan rumen bervariasi tergantung pada tingkat degradasi protein pakan berkisar antara 0 sampai 130 mg/100 mL.

Protein yang masuk ke dalam rumen akan didegradasi oleh mikrobia rumen memberikan hasil akhir NH₃, dan gas berbentuk CO₂ dan CH₄. Sebagian NH₃ akan digunakan mikrobia sebagai sumber nitrogen sedangkan sebagian lagi akan dikeluarkan melalui dinding rumen, selanjutnya melalui pembuluh darah akan dibawa ke hati. Sebagian urea akan menuju ginjal yang akan dikeluarkan sebagi urine sedangkan lainnya akan didaur ulang menuju saliva atau dikembalikan ke dalam rumen.

 

 

Kesimpulan

 

 

Kadar protein enzim mikrobia sebesar 72,8 mg/100mL , kemudian kadar gula mereduksi  sebesar 18,93 x 10⁶ mg/L  dan kadar ammonia sebesar 0,307 mg/100mL. Populasi mikrobia di cairan rumen dipengaruhi oleh sintesis protein mikroba tergantung pada N yang cocok dan sumber karbohidrat. Aktivitas enzim ditentukan oleh difusi aktivator atau inhibitor, luas permukaan, dari katabolit, konten pretreatment, dan komposisi gula substrat.

 

 

Daftar Pustaka

 

Abidin, Zainal. 2008. Penggemukan Sapi Potong. AgroMedia Pustaka. Jakarta.

Ginting, Simon et.al. 2012. Indigofera sebagai Pakan Ternak. IAARD Press.Jakarta.

Lamid, Mirni, Tri Prasetyo N, Sri Chusniati, dan Kusriningrum R. 2011. Eksplorasi bakteri selulolitik asal cairan rumen sapi potong sebagai bahan inokulum limbah pertama. Jurnal Ilmu Kedokteran Hewan Vol 4,No 1.

Meryandini, Anja, Nunuk Widhyastuti dan Yulin Lestari. 2008. Pemurnian dan karakterisasi xilanase Streptomyces Sp. Skk1-8. Makara, Sains, Volume 12, No. 2, November 2008: 55-60

Nurhaita, N. Jamarun, R.Saladin, L.Warly, dan Z. Mardiati. 2008. Efek suplementasi mineral sulfur dan pospor pada daun sawit amoniasi terhadap kecernaan zat makanan secara in vitro dan karakteristik cairan rumen. Jurn. Indon. Trop. Anim. Agric, 33 (1).

Prabowo, A, Padmowijoto, Z. Bachrudin , dan A.Syukur. 2007. Potensi mikrobia selulolitik campuran dari ekstrak rayap, larutan feses gajah dan cairan rumen kerbau. Jurnal Indon. Trop. Anim. Agric.32 (3).

Sari,Nur Indah, Ahyar A, dan Seniwati D. 2014. Isolasi dan karakterisasi Protein Bioaktif dari spons Callyspongia Sp sebagai zat antioksidan. Jurusan Kimia Universitas Hasanudin.

Sodiq,Akhmad dan Zainal Abidin. 2008. Meningkatkan Produksi Susu Kambing Ettawa. AgroMedia Pustaka. Jakarta.

Sutarno. 2005. Pengaruh ph terhadap Aktivitas Endo-1,4-β-Glucanase Bacillus Sp. AR 009. Biodiversitas, Vol.6 No.4.

Yuwono,Triwibowo. 2010. Biologi Molekular. Penerbit Erlangga. Jakarta.

 

 

PERHITUNGAN

1. Protein Mikrobia

Y = 0,318

Y = 0,0025 X + 0,0146

Y = absorbansi produk

X = kadar protein mikrobia (mg/mL)

0,318 = 0,0025 X + 0,0146

0,0025 X  = 0,318 – 0,0146

 

X = 121,36 mg/mL  x 6 (faktor pengenceran)

X  = 728,16 µ/mL  1000

= 0,72816 mg/mL x 100 ml

= 72,8 mg/100ml

2. Aktvitas Enzim CMC-ase

BL2	: 0,414	E28	: 0,398
ES28	: 0,286	E2	: 0,004
S2	: 0,515

Y = 0,002034 X + 0,01858

Y = absorbansi produk

X = kadar gula mereduksi

Abs Y    = Abs (BL2-ES28) – (BL2-E28) – (BL2-S2)

= Abs (0,414-0,286) – (0,414-0,398) – (0,414-0,515)

= Abs (0,128-0,016+0,10)

= Abs 0,213

0,213     = 0,002034 X + 0,01858

X  =

= 95,585 µmol/ml

95,585 x 10^-3

= 18,93 x 10⁶ mg/L

3. NH₃ Cairan Rumen

Y = 0,237

Y = 0,0068 X + 0,0278

Y = absorbansi produk

X = kadar NH₃ (mg/100ml)

0,237 = 0,0068 X + 0,0278

 

X  = 0,3069 mg/100 ml